反相液相色譜法分離和測定富馬酸
2011-11-03
[8202]
摘 要 采用反相液相色譜法測定富馬酸。在μ-Bondapark C18色譜柱上以含0.5%乙酸的水溶液作為流動相能較好地分離富馬酸和馬來酸試樣，當其流速為1.0 mL/min時，富馬酸與馬來酸的分離因子的分離度達1.52。該方法操作簡便、快速、定量準確、可靠。
1 引 言
富馬酸是一種重要的精細化工產品的原料。它可用于合成不飽和聚酯樹脂，它與醋酸乙烯的共聚物是良好的粘合劑，與苯乙烯的共聚物是制造玻璃鋼的材料；它也是一種食品添加劑（酸味劑），并可用于合成新型防霉劑——霉克星。此外，它也是重要的醫藥原料，如反丁烯二酸鐵用于冶療小紅血球型貧血的富血鐵〔1〕。有關其殘留的分析測定國內外已有報道〔2～5〕，但有關其工業生產的控制分析國內外尚未見報道。我們采用反相液相色譜法分離和測定工業產品中富馬酸含量以及馬來酸樣品中富馬酸雜質含量。實驗結果表明，該方法*適合于工業產品中富馬酸的含量的測定和馬來酸試樣中富馬酸雜質的測定。
2 實驗部分
2.1 試劑和儀器
Shimadzau LC-4A液相色譜儀；Waters 4801 液相色譜光譜檢測儀；Waters 991二極管陣列檢測儀；Shimadzu C-R2A色譜數據處理儀；
富馬酸標準品：99%（浙江工業大學化工學院精細化工研究室）；馬來酸標準品：98%（浙江工業大學化工學院精細化工研究室）；其它所用試劑均為分析純試劑。富馬酸及馬來酸樣品是由浙江工業大學精細化工研究室提供的小試合成樣品。
2.2 液相色譜條件
色譜柱： C18色譜柱（30 cm×3.9 mm I.D）；流動相：含0.5%乙酸的水溶液；流速：1.0 mL/min；檢測波長：240 nm（靈敏度為0.01 AU）。進樣量：20μL。
富馬酸是一種重要的精細化工產品的原料。它可用于合成不飽和聚酯樹脂，它與醋酸乙烯的共聚物是良好的粘合劑，與苯乙烯的共聚物是制造玻璃鋼的材料；它也是一種食品添加劑（酸味劑），并可用于合成新型防霉劑——霉克星。此外，它也是重要的醫藥原料，如反丁烯二酸鐵用于冶療小紅血球型貧血的富血鐵〔1〕。有關其殘留的分析測定國內外已有報道〔2～5〕，但有關其工業生產的控制分析國內外尚未見報道。我們采用反相液相色譜法分離和測定工業產品中富馬酸含量以及馬來酸樣品中富馬酸雜質含量。實驗結果表明，該方法*適合于工業產品中富馬酸的含量的測定和馬來酸試樣中富馬酸雜質的測定。
2 實驗部分
2.1 試劑和儀器
Shimadzau LC-4A液相色譜儀；Waters 4801 液相色譜光譜檢測儀；Waters 991二極管陣列檢測儀；Shimadzu C-R2A色譜數據處理儀；
富馬酸標準品：99%（浙江工業大學化工學院精細化工研究室）；馬來酸標準品：98%（浙江工業大學化工學院精細化工研究室）；其它所用試劑均為分析純試劑。富馬酸及馬來酸樣品是由浙江工業大學精細化工研究室提供的小試合成樣品。
2.2 液相色譜條件
色譜柱： C18色譜柱（30 cm×3.9 mm I.D）；流動相：含0.5%乙酸的水溶液；流速：1.0 mL/min；檢測波長：240 nm（靈敏度為0.01 AU）。進樣量：20μL。
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在此操作條件下，富馬酸和馬來酸樣品及其標準溶液的色譜圖如圖1所示。
圖1 富馬酸試樣的色譜圖
Fig.1 Chromatogram of fumaric acid samples
a.富馬酸和馬來酸混合標準溶液（standard solution of fumaric acid and malic acid mixture）；b.富馬酸樣品（fumaric acid sample）；c.馬來酸樣品（malic acid sample）。1.馬來酸（malic acid）；2.富馬酸（fumaric acid）。
μ-Bondapark C18色譜柱（30 cm×3.9 mm I.D）。
2.3 標準溶液的配制
準確稱取富馬酸標準品約0.015 g（至±0.01 mg）置于10 mL容量瓶中，用5 mL甲醇溶解并用流動相稀釋至刻度。然后逐步稀釋得不同濃度的標準溶液，其濃度分別為1.5×10-3，3.0×10-3，4.5×10-3，6.0×10-3，7.5×10-3，10.5×10-3，15.0×10-3 g/L。
2.4 樣品溶液的配制
準確稱取一定量試樣（至±0.01 mg）置于10 mL容量瓶中，用5 mL甲醇溶解并用流動相稀釋至刻度。然后逐步稀釋至一定濃度，待測定。
3 結果與討論
3.1 流動相選擇
作者首先考察了不同流動相對試樣中富馬酸與其雜質的分離效果，發現試樣在100%甲醇為流動相和以純水為流動相時試樣中的富馬酸及雜質馬來酸等出峰較快，基本上與溶劑一起流出，而當流動相為含乙酸水溶液時富馬酸與馬來酸等之間具有較好的分離效果，而且流動相中乙酸含量不同對其分離效果產生明顯影響。
隨著乙酸濃度的增加，馬來酸的容量因子（k′1）隨之減少，而富馬酸的容量因子（k′2）先隨乙酸濃度的增加而增加，當乙酸濃度＞1.0%時，其容量因子顯著減少。從而使馬來酸與富馬酸之間的分離因子（α）和分離度（R）在流動相中乙酸濃度為1.0%時，兩者均達到zui大值，即α=2.02，R=2.32。同時考慮到色譜柱的使用壽命，我們認為采用含0.5%乙酸水溶液為流動相較為合適，因為當采用0.5%乙酸水溶液為流動相時，馬來酸與富馬酸之間的分離因子和分離度分別達1.62和1.52，已滿足定量測定要求。
3.2 流速的影響
實驗結果表明，當以含0.5%乙酸水溶液為流動相時，在室溫下改變其流速時，其保留時間、柱效均發生變化，即隨著流速的降低，保留時間和柱效隨之增加，而容量因子（k′）基本不變。這是由于流速降低時，流動相中傳質阻力Hm、停滯流動相中傳質阻力Hsm和固定相內傳質阻力Hs都降低，縱向分子擴散雖有所增加，但在此濃度范圍內，前三項的影響是主要的，后一項可忽略。因此，流速降低，柱效增大。而容量因子（k′）是熱力學參數，它與流動相的流速無關，因此流動相的流速的變化基本不影響馬來酸與富馬酸之間的分離因子，其α=1.57，流速選為1.0 mL/min。
3.3 檢測波長的選擇
富馬酸是一個不飽和有機酸，它受紫外光的激發后可以發生σ→π*，π→π*，n→π*躍遷，因此它在紫外的短波區有強烈的吸收，λmax,CH3OH=207 nm。實驗結果表明，在乙酸/水體系中富馬酸在λ=240 nm附近有強吸收。
乙酸濃度對富馬酸和馬來酸的紫外吸收帶有著明顯的影響，當乙酸濃度增加時，富馬酸的zui大吸收波長顯著向長波方向位移，即產生紅移。當乙酸濃度從0.5%增加到2.0%時，富馬酸的zui大吸收波長從236 nm位移至248 nm。并且，隨著乙酸濃度的增加，兩者的紫外吸收譜帶變狹。為此，選用0.5%乙酸溶液為流動相時，測定波長選擇為λ=240 nm。
3.4 溶劑的選擇
實驗結果表明，試樣經甲醇溶解后采用不同溶劑稀釋，其色譜圖明顯不同，如用水稀釋時色譜圖中產生一個較大的體系峰（負峰），而且該體系峰與馬來酸的色譜峰非常接近；而采用流動相稀釋時，體系峰較小，使體系峰與馬來酸的峰*分離。因此，選擇流動相作為稀釋溶劑。
3.5 方法的線性范圍和檢測限
將不同濃度的標準溶液在上述選定的色譜測定條件下分別進行分析測定,進樣體積為20 μL。以濃度（C）為橫坐標,峰面積（A）為縱坐標繪制標準曲線。實驗結果表明,富馬酸的濃度在2.4×10-3～12.2×10-3 g/L內，富馬酸的濃度與其峰面積呈現良好的線性關系,線性回歸方程為A=0.1933C+0.0452（r=0.9979）。方法的檢測限為7.7×10-2 mg/L（按信噪比2∶1）。
3.6 精密度和準確度
為了考察該方法的重現性,對同一試樣進行了5次重復測定的標準偏差為0.81,相對標準偏差為0.91%。
在已知含量的樣品中加入一定量的標準品后進行多次測定。測得富馬酸的回收率為 98.86%～103.9%,平均回收率為101.0%。
表1 樣品中富馬酸含量測定結果
Table 1 Determination results of concentration of fumaric acid in sample
樣 品
Sample 測定結果 Determination results （%） 平均值
Mean value （%）
1 2 3
馬來酸樣品 Malic acid sample 8.80 9.06 8.84 8.90
富馬酸樣品 Fumaric acid sample 88.74 87.50 87.96 88.07
3.7 實際樣品的測定
該方法用于測定富馬酸和馬來酸樣品中富馬酸含量，結果見表1。實驗結果表明，該方法*適合于富馬酸產品和馬來酸產品中富馬酸含量測定。
作者單位：施介華（浙江工業大學化工學院，杭州 310032）
徐秀珠（浙江大學分析測試中心，杭州 310027）
References
［1］ Zhang Sigui（章思規），Xin Zhong（辛 忠）. Handbook of Preparation of Fine Organic Chemical Engineering（精細有機化工制備手冊）. Beijing（北京）：Science and Technology Literature Press （科學技術文獻出版社），1994:386～387
［2］ Chen Dayi（陳大義）. Chinese J. Preventive Medicine（中華預防醫學雜志），1996，30（1）：52
［3］ Yu Zhaolou（余兆樓），Chang Liwen（常理文）. Chinese J. Chromatogr.（色譜），1992，10（6）：336～338
［4］ Dietz E A, Singley K F. J. Liq. Chromatogr., 1994, 17（7）:1637～1651
［5］ Llorente M, Villaroya B, Gomez-Cordoves C. Chromatographia, 1991, 32（11／12）:555～558
在此操作條件下，富馬酸和馬來酸樣品及其標準溶液的色譜圖如圖1所示。
圖1 富馬酸試樣的色譜圖
Fig.1 Chromatogram of fumaric acid samples
a.富馬酸和馬來酸混合標準溶液（standard solution of fumaric acid and malic acid mixture）；b.富馬酸樣品（fumaric acid sample）；c.馬來酸樣品（malic acid sample）。1.馬來酸（malic acid）；2.富馬酸（fumaric acid）。
μ-Bondapark C18色譜柱（30 cm×3.9 mm I.D）。
2.3 標準溶液的配制
準確稱取富馬酸標準品約0.015 g（至±0.01 mg）置于10 mL容量瓶中，用5 mL甲醇溶解并用流動相稀釋至刻度。然后逐步稀釋得不同濃度的標準溶液，其濃度分別為1.5×10-3，3.0×10-3，4.5×10-3，6.0×10-3，7.5×10-3，10.5×10-3，15.0×10-3 g/L。
2.4 樣品溶液的配制
準確稱取一定量試樣（至±0.01 mg）置于10 mL容量瓶中，用5 mL甲醇溶解并用流動相稀釋至刻度。然后逐步稀釋至一定濃度，待測定。
3 結果與討論
3.1 流動相選擇
作者首先考察了不同流動相對試樣中富馬酸與其雜質的分離效果，發現試樣在100%甲醇為流動相和以純水為流動相時試樣中的富馬酸及雜質馬來酸等出峰較快，基本上與溶劑一起流出，而當流動相為含乙酸水溶液時富馬酸與馬來酸等之間具有較好的分離效果，而且流動相中乙酸含量不同對其分離效果產生明顯影響。
隨著乙酸濃度的增加，馬來酸的容量因子（k′1）隨之減少，而富馬酸的容量因子（k′2）先隨乙酸濃度的增加而增加，當乙酸濃度＞1.0%時，其容量因子顯著減少。從而使馬來酸與富馬酸之間的分離因子（α）和分離度（R）在流動相中乙酸濃度為1.0%時，兩者均達到zui大值，即α=2.02，R=2.32。同時考慮到色譜柱的使用壽命，我們認為采用含0.5%乙酸水溶液為流動相較為合適，因為當采用0.5%乙酸水溶液為流動相時，馬來酸與富馬酸之間的分離因子和分離度分別達1.62和1.52，已滿足定量測定要求。
3.2 流速的影響
實驗結果表明，當以含0.5%乙酸水溶液為流動相時，在室溫下改變其流速時，其保留時間、柱效均發生變化，即隨著流速的降低，保留時間和柱效隨之增加，而容量因子（k′）基本不變。這是由于流速降低時，流動相中傳質阻力Hm、停滯流動相中傳質阻力Hsm和固定相內傳質阻力Hs都降低，縱向分子擴散雖有所增加，但在此濃度范圍內，前三項的影響是主要的，后一項可忽略。因此，流速降低，柱效增大。而容量因子（k′）是熱力學參數，它與流動相的流速無關，因此流動相的流速的變化基本不影響馬來酸與富馬酸之間的分離因子，其α=1.57，流速選為1.0 mL/min。
3.3 檢測波長的選擇
富馬酸是一個不飽和有機酸，它受紫外光的激發后可以發生σ→π*，π→π*，n→π*躍遷，因此它在紫外的短波區有強烈的吸收，λmax,CH3OH=207 nm。實驗結果表明，在乙酸/水體系中富馬酸在λ=240 nm附近有強吸收。
乙酸濃度對富馬酸和馬來酸的紫外吸收帶有著明顯的影響，當乙酸濃度增加時，富馬酸的zui大吸收波長顯著向長波方向位移，即產生紅移。當乙酸濃度從0.5%增加到2.0%時，富馬酸的zui大吸收波長從236 nm位移至248 nm。并且，隨著乙酸濃度的增加，兩者的紫外吸收譜帶變狹。為此，選用0.5%乙酸溶液為流動相時，測定波長選擇為λ=240 nm。
3.4 溶劑的選擇
實驗結果表明，試樣經甲醇溶解后采用不同溶劑稀釋，其色譜圖明顯不同，如用水稀釋時色譜圖中產生一個較大的體系峰（負峰），而且該體系峰與馬來酸的色譜峰非常接近；而采用流動相稀釋時，體系峰較小，使體系峰與馬來酸的峰*分離。因此，選擇流動相作為稀釋溶劑。
3.5 方法的線性范圍和檢測限
將不同濃度的標準溶液在上述選定的色譜測定條件下分別進行分析測定,進樣體積為20 μL。以濃度（C）為橫坐標,峰面積（A）為縱坐標繪制標準曲線。實驗結果表明,富馬酸的濃度在2.4×10-3～12.2×10-3 g/L內，富馬酸的濃度與其峰面積呈現良好的線性關系,線性回歸方程為A=0.1933C+0.0452（r=0.9979）。方法的檢測限為7.7×10-2 mg/L（按信噪比2∶1）。
3.6 精密度和準確度
為了考察該方法的重現性,對同一試樣進行了5次重復測定的標準偏差為0.81,相對標準偏差為0.91%。
在已知含量的樣品中加入一定量的標準品后進行多次測定。測得富馬酸的回收率為 98.86%～103.9%,平均回收率為101.0%。
表1 樣品中富馬酸含量測定結果
Table 1 Determination results of concentration of fumaric acid in sample
樣 品
Sample 測定結果 Determination results （%） 平均值
Mean value （%）
1 2 3
馬來酸樣品 Malic acid sample 8.80 9.06 8.84 8.90
富馬酸樣品 Fumaric acid sample 88.74 87.50 87.96 88.07
3.7 實際樣品的測定
該方法用于測定富馬酸和馬來酸樣品中富馬酸含量，結果見表1。實驗結果表明，該方法*適合于富馬酸產品和馬來酸產品中富馬酸含量測定。
作者單位：施介華（浙江工業大學化工學院，杭州 310032）
徐秀珠（浙江大學分析測試中心，杭州 310027）
References
［1］ Zhang Sigui（章思規），Xin Zhong（辛 忠）. Handbook of Preparation of Fine Organic Chemical Engineering（精細有機化工制備手冊）. Beijing（北京）：Science and Technology Literature Press （科學技術文獻出版社），1994:386～387
［2］ Chen Dayi（陳大義）. Chinese J. Preventive Medicine（中華預防醫學雜志），1996，30（1）：52
［3］ Yu Zhaolou（余兆樓），Chang Liwen（常理文）. Chinese J. Chromatogr.（色譜），1992，10（6）：336～338
［4］ Dietz E A, Singley K F. J. Liq. Chromatogr., 1994, 17（7）:1637～1651
［5］ Llorente M, Villaroya B, Gomez-Cordoves C. Chromatographia, 1991, 32（11／12）:555～558
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